非线性声片显微镜：在毛细血管/细胞尺度上对不透明器官进行成像

[正文内容]

活体组织深层可视化一直是一个挑战。Heiles 等人开发了一种方法，可以生成基因表达的三维 (3D) 超声图像和毛细血管的二维超声图像。该方法背后的基本思想（称为非线性声片显微镜，Nonlinear sound-sheet microscopy (NSSM)）很简单：细胞中表达的生物分子或在血管中循环的微泡在穿过样本的薄超声片上被激发。这种方法能够对用回声报告基因标记的活体不透明器官进行快速、深入和体积成像。通过调节沿非衍射光束的声压，将生物分子或微泡的非线性回波限制在一个平面内，从而实现超声分层，即在 z 平面上分辨结构的能力。—Stella M. Hurtley

结构化摘要

引言

生物学领域的发现往往需要新的可视化方法。一种用于观察活体生物体内动态细胞过程的最具信息性的方法是利用基因编码的荧光报告蛋白的光片显微镜。不幸的是，光学显微镜对细胞具有光毒性，并且仍然局限于对薄而透明的标本的研究。高频超声的物理特性非常适合 in vivo 细胞成像，它结合了深度穿透（~1 厘米）和高时空分辨率（~100 微米，1 毫秒）。此外，最近引入的基因编码气体囊泡 (GVs) 作为“用于超声的绿色荧光蛋白”，为 in vivo 细胞功能研究创造了新的机会。为了使超声具备类似于荧光蛋白赋予光学显微镜的能力，需要快速、高分辨率和体积超声成像方法，能够可视化声学报告基因和声学生物传感器。如果能够实现这一点，由此产生的能力将使研究人员能够以前所未有的信息含量、分辨率、覆盖范围以及对生物研究和临床开发的转化能力，探索以前无法触及的 in vivo 细胞生物学。

原理

我们引入了非线性声片显微镜 (NSSM) 的概念，这是一种能够检测薄活体组织切片中基因编码的 GVs 和合成脂质壳微泡 (MBs) 的方法。该方法背后的基本思想是调节非衍射超声光束主瓣沿线的声压，以将 GVs 和 MBs 的非线性散射限制在薄组织切片中。由于 GVs 和 MBs 以非线性的方式响应不断增加的声压水平，因此可以将它们与以线性方式响应不断增加的声压水平的周围组织区分开来。为了最大化 NSSM 的体积视野，我们在一类称为行-列寻址 (RCA) 阵列的高频超声换能器上开发了我们的成像方法。在我们目前的实现中，成像视野约为 1 立方厘米。

结果

首先，我们评估了 NSSM 在三维空间中检测细菌声学报告基因的能力。成功地沿 15-MHz RCA 阵列的两个正交方向检测到经过基因工程改造以组成型表达非线性散射 GVs 的 Escherichia coli 。通过沿 RCA 阵列的两个正交方向以电子方式扫描声片平面，我们捕获了跨越 8.8 × 8.8 × 10 立方毫米的细菌声学报告基因的体积图像。其次，我们对基因标记的肿瘤进行了纵向 NSSM，并揭示了几天内 GV 表达的三维 (3D) 模式。我们表明，NSSM 可用于跟踪肿瘤生长，也可用于量化肿瘤和坏死核心的体积。第三，我们证明 NSSM 能够检测合成脂质壳 MBs，这是一类用作血管报告蛋白的共振超声造影剂。在任意选择的平面中使用千赫兹帧速率的 NSSM，我们获得了整个大脑中大鼠脑血管系统的非线性多普勒图像。最后，NSSM 与超声定位显微镜相结合，使我们能够绘制低于 3 毫米/秒的脑血流，从而揭示了 100 微米厚组织切片中活大鼠大脑的毛细血管系统。

结论

我们证明了 NSSM 能够将基因编码的 GVs 和合成脂质壳 MBs 的非线性散射限制到波长薄的不透明组织切片。NSSM 是一种可以针对速度或覆盖范围进行调整的成像方法。在二维空间和 15 MHz 的超声频率下，NSSM 可以扫描 1 厘米深，理论帧速率为 25.6 kHz。在三维空间中，NSSM 可以 233 Hz 的理论体积速率获取 8.8 × 8.8 × 10 立方毫米的组织体积。为了充分利用 NSSM，必须开发新一代更亮的声学报告基因和更快的生物传感器。此外，应进一步提高 NSSM 的灵敏度，以实现单细胞检测。如果我们成功了，NSSM 将为跨尺度的生物过程的动态成像研究带来一波机会。

非线性声片显微镜。

一次激发一个平面的声学报告蛋白的能力使分子超声成像能够在细胞和毛细血管尺度上进行。（i）在 NSSM 中，声学报告蛋白的非线性散射被限制在跨越 0.1 × 10 × 9 立方毫米的薄声片中。（ii）正交扫描声片成像能够对不透明器官中的基因表达进行 3D 可视化，而（iii）声片定位显微镜能够对脑毛细血管进行深度超分辨率成像。p , RCA 的音高。在本研究中，p /2 等于 55 微米。

摘要

光片荧光显微镜通过可视化三维动态细胞过程彻底改变了生物学。然而，厚组织中的光散射和荧光报告蛋白的光漂白限制了该方法只能研究薄或半透明的标本。在这项研究中，我们应用了非衍射超声光束结合交叉幅度调制序列和非线性声学报告蛋白，以实现对靶向生物功能的快速和体积成像。我们报告了使用基因编码气体囊泡在立方厘米尺度上对肿瘤基因表达进行体积成像，以及使用血管内微泡造影剂对脑毛细血管网络进行定位显微镜成像。与生物分子超声的最新技术相比，非线性声片显微镜在成像速度上提供了约 64 倍的加速，在成像体积上增加了约 35 倍，在经典成像分辨率上增加了约 4 倍。