Breslow假说的证实：一种在液态水中稳定的 Carbene

Varun Tej Raviprolu, Aaron Gregory https://orcid.org/0000-0002-5075-9934, [...] , Isaac Banda https://orcid.org/0009-0001-5885-7387, Scott G. McArthur, [...] , Sarah E. McArthur https://orcid.org/0009-0003-0742-2476 vincentl@ucr.edu, William A. Goddard III https://orcid.org/0000-0003-0097-5716 vincentl@ucr.edu, Charles B. Musgrave III https://orcid.org/0000-0002-3432-0817 vincentl@ucr.edu, and Vincent Lavallo https://orcid.org/0000-0001-8945-3038 vincentl@ucr.edu+5 authors +3 authors fewerAuthors Info & Affiliations Science Advances 11 Apr 2025 Vol 11, Issue 15 DOI: 10.1126/sciadv.adr9681

摘要

1958年，Breslow 提出辅酶硫胺素，又称维生素 B1，充当瞬时 Carbene 的来源，促进各种重要酶的催化活性。 这是一个有争议的假说，因为当时和现在一样，人们认为 Carbene 与水不相容。 尽管氘标记实验和所谓的 Breslow 中间体的捕获等证据支持 Breslow 的假设，但从未有光谱证据证明 Carbene 可以在水中存在或产生。 在本研究中，我们公开了一种 Carbene 的合成和完整的核磁共振光谱表征以及单晶结构，该 Carbene 可以在水中生成并作为稳定物质分离出来，从而明确地验证了 Breslow 的有远见的假设。

介绍

硫胺素 1（图 1），更常见的名称是维生素 B1，是人类和其他生命必不可少的微量营养素。 硫胺素的磷酸化形式对于某些代谢途径至关重要 (1)。 例如，1 以其焦磷酸酯辅羧酶的形式，是许多重要的水相生化途径的辅酶，例如丙酮酸脱羧成乙醛和丙酮酸转化为乙偶姻 (2)。 这些酶的活性已被证明需要结合 1 并且是 pH 依赖性的 (3)。 这种行为，加上所有已知的这些酶活性位点的晶体结构都在晶格中含有水 (4–6)，表明观察到的催化过程可以耐受水。 活性位点中的环境还包含一个 Mg2+ 离子，并且化学反应不会发生在受保护的疏水性口袋中 (6)。 此外，最近对相关转酮醇酶的研究表明，质子转移到结合的 1 的氨基嘧啶环的氨基上是由水分子辅助的，并且是催化剂活化的关键组成部分 (7)。 此外，1 (8) 和各种其他噻唑鎓盐和 N -杂环盐已被证明可以在碱存在下催化相关的活化醛反应 (Ümpolung) (9)，在水性和非水性环境中，例如经典的苯偶姻和酰偶姻缩合反应。 虽然最初人们对它的了解不多，但在 1958 年，根据在 D2O 中的氘标记实验以及 1 本身可以诱导水中催化的事实，Breslow (10) 提出从硫胺素残基产生的活性物质是 N -杂环 Carbene (NHC)，噻唑亚基 1′。 提出 Carbene (11)，一种通常非常活泼的分子，具有二价碳原子和非键合电子对，可以持续足够长的时间以进行精确控制的化学反应，更不用说在水中了，这是一个有远见的假设。 人们认为该机制以类似于 1903 年提出的经典 Lapworth 途径 (12) 的方式发生，用于氰化物催化的苯偶姻缩合反应。 尽管从未有任何光谱证据表明 Carbene 在水中形成，但 Breslow 的假设已被科学界接受为正确的。 另一个被提议为这些反应途径中的关键中间体的重要化合物，即所谓的 Breslow 中间体，来源于 NHC 与醛的加成以及随后的互变异构化，最近已被分离出来 (13)。

图 1. Carbene 的例子。 (A) Breslow 提出的来源于硫胺素的 NHC (10)。 (B) 按时间顺序排列的感兴趣的可分离 Carbene (16、17、21–22)。

随后，在 1968 年，Wanzlick 和 Schönherr (14) 以及 Öfele (15) 独立表明，NHC 金属配合物可以通过咪唑鎓盐与碱性过渡金属前体的接触形成，这意味着这些配合物可能是通过瞬时无金属 NHC 的形成而产生的。 多年来，Wanzlick 一直试图分离这些所谓的咪唑亚基，但没有成功。 这些开创性的工作为 Bertrand 及其同事 (16) 和 Arduengo et al. (17) 发现了第一个可装瓶 Carbene 和 NHC，即液体磷酰基硅基 Carbene 2′ 和固体 N ,N -二金刚烷基咪唑亚基 3′ 。 3′ 的发现为使用这些咪唑亚基和相关物质（如环状烷基氨基 Carbene (18) 和 Carbones (19)）作为基于过渡金属的催化剂的强大配体和反应性主族化合物的稳定物质铺平了道路 (20)。

第一批可分离的 Carbene 2′ 或 3′ 都不耐空气，可能是因为我们大气中的气态水和其他反应性物质，如 CO2。 然而，Arduengo et al. (21) 通过他们对唯一已知的“耐空气”NHC 4′ 的报告，将 Carbene 的稳定性提高到了更高的水平，该 NHC 具有双重氯化的咪唑亚基骨架，并且 Carbene 中心两侧是两个 N -均三甲苯基。 骨架的双重氯化被认为是关键，因为它通过 σ-感应效应稳定了 NHC 孤对电子。 在该手稿中，Arduengo 声称，这种分子的苯溶液暴露在空气中搅拌后，几天内没有表现出分解迹象，这意味着原则上，这种 Carbene 应该是工作台稳定的。 没有报告这种 NHC 实际上是否对与水接触稳定。 然而，令人费解的是，在这种化合物的苯溶液中搅拌的苯溶液不会轻易地与从空气中吸收的水发生反应，因此，原则上，该化合物可能对液态水不具有反应性。 随后，Denk 及其合作者 (22) 表明，t -丁基取代的 NHC 5′ 的四氢呋喃 (THF) 溶液与一当量的水反应时，在 3 个月内会缓慢水解。 已经报道了用非常大的 N -芳基基团来防止二聚化的可分离噻唑亚基的单个例子，但它对水高度敏感 (23)。 然而，硫胺素及其衍生物中存在的其他酸性和反应性位点，以及缺乏空间保护，排除了通过核磁共振 (NMR) 或其他方法分离甚至观察这些提议的 Carbene 中间体的可能性。 在这里，据我们所知，我们报告了第一个真正耐水的 Carbene。 该分子似乎无限期地存在于液态水溶液中，并且我们提供了光谱学证据，表明这种 Carbene 不仅对水稳定，而且还可以在水中生成。 虽然碳硼烷支架可能不能完全模拟 Breslow 想到的酶的活性位点，但它确实以某种方式模拟了活性位点，提供了一个保护性的口袋，其中氯化的笼子既热力学上有利于 Carbene 的形成，又动力学上保护了该二价碳中心。 尽管如此，我们的研究明确地证实了 Breslow 的假设，即在适当的情况下，可以在水性环境中生成持久的 Carbene。

结果

在过去的十年中，我们一直在开发带有功能化碳硼烷簇的配体，用于各种应用 (24)。 最近，我们表明可以制备带负电荷的咪唑鎓盐 6 和相应的带两个负电荷的碳烯化合物 6′，它们带有 10-顶点 closo -碳硼烷阴离子（10-顶点；CB91−；图 2A) (25)。 类似于我们用带有 12-顶点 N -碳硼烷基团 (CB111−) 的多卤代碳硼烷基 NHC 所展示的 (26)，我们有兴趣开发具有较小 10-顶点簇的这些配体的类似物，以用于弱配位但具有反应性的有机金属和主族离子对的研究。

图 2. 7′ 的合成和测定。 (A) 碳烯化合物 6′ 和 Carbene 7′ 的合成。 当 LiHMDS 用作碱且纯 THF 用作溶剂时，该反应是干净且定量的。 (B) 三维空间填充模型。 (C) 热椭球图绘制到 50% 的概率。 颜色代码：C，灰色； B，棕色； N，蓝色； Cl，绿色。 请注意，为了清楚起见，省略了两个 Li(THF)4+ 抗衡离子。

我们了解到，带有阴离子 12-顶点氢化物 N -碳硼烷基簇的咪唑鎓盐的过氯化是不可能的（该反应可能由于空间原因而永远不会完成）； 然而，我们发现较小的咪唑鎓阴离子 6 可以完全氯化，包括咪唑鎓骨架，以产生 7 (图 2A)。 通过添加两个当量的双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂 (LiHMDS)，可以定量地轻松形成相应的 Carbene 7′。 7′ 的 1H 核磁共振分析表明，如预期的那样，咪唑鎓质子不存在，而 11B 核磁共振表明共振发生移动，但保留了局部 C 4 v 对称性，这与定量地形成单一化合物是一致的。 13C 核磁共振谱最具指导意义，因为它显示 Carbene 碳共振相对于碳烯化合物 6′（200 ppm）明显向下移动 [对于 7′，为百万分之 239 (ppm)]，这与 20 个吸电子基团 Cl 产生的去屏蔽效应是一致的。 7Li 核磁共振分析显示一个 Li 峰，对应于 Li+(THF4)，表明与 6′ 相比，7′ 是溶液中的游离 Carbene。 7′ 的结构通过单晶 X 射线衍射明确确定，这表明该物质是游离的二阴离子 Carbene，而不是固态下的碳烯化合物 (图 2C)。 固态结构的空间填充模型 (图 2B) 显示了簇氯化物为 Carbene 中心的 σ-孤对电子和 π 轨道提供的空间屏蔽。 最靠近 Li+ 距离的 Carbene 碳大于 10 Å，证实 7′ 在固态下持续存在为游离 Carbene。 所有尝试获得晶格中含有水或与 Li+ 阳离子结合的晶体结构的尝试均未成功，因为即使在水的存在下，它们始终会导致相同的结构（参见下文）。

核磁共振样品是在手套箱中的普通核磁共振管中制备的，盖子用电工胶带包裹，以减缓空气扩散到样品中，而不是使用更昂贵的 J Young 型管。 我们注意到，如果样品在工作台上放置几天，则核磁共振谱保持完全不变，没有表现出通过水解分解的迹象。 对于大多数 NHC 来说，这是相当不寻常的，除了上面提到的报告之外，并且这种观察激发了我们对这种化合物潜在水稳定性的好奇心。 将自来水添加到 Carbene 的 THF 溶液中，直至水饱和（单相溶液），我们注意到 Carbene 立即质子化并重新形成起始物质，但没有发生水解。 我们假设，可能自来水中 CO2 溶解产生的碳酸等杂质导致了观察到的质子化。 因此，我们在氩气下小心地蒸馏了水，并在 J Young 管中重复了实验，令人惊讶的是，即使在大量过量的水中，NHC 仍然完全完好无损，没有任何质子化或任何类型分解的迹象。 通过核磁共振波谱监测该样品和其他几个样品超过 6 个月，绝对没有显示出 Carbene 的分解； 因此，据我们所知，它是第一个真正耐水的 Carbene。

接下来，我们尝试用 LiOH 在纯水中生成 Carbene，但了解到由于 7 不溶于水，因此反应没有进行。 因此，我们在水悬浮液中添加了足够的 THF 以溶解 7，并发现 7′ 在这些水性条件下形成，同时还有其他未鉴定的副产物。 然而，我们能够通过调整水/THF 比率和添加顺序来优化条件，以生成 Carbene 7′ 作为唯一产物 (图 3)。 优化的条件包括将咪唑鎓盐溶解在 1.0 ml THF 中，然后缓慢添加 2 当量溶解在 0.15 ml 纯水中的 LiOH。 图 3 显示了混合两种溶液后立即获得的反应混合物的实际粗 13C 核磁共振谱。 在 239 ppm 处的唯一 Carbene 碳和在 117 ppm 处的骨架峰显示了 Carbene 7′ 在水中的干净形成。 由于该 C 原子与笼子中两种不同的四极 B 核（天然丰度：11B = 80%，自旋 3/2；10B = 20%，自旋 3）的不同组合的耦合，因此碳硼烷碳不明显。 观察到的唯一其他共振是 THF 溶剂和从 HNMe3+ 释放的 NMe3 的共振。

图 3. NHC 7′ 在水性介质中的形成。 用水 THF 混合物中的 LiOH 生成耐水 Carbene 7′ 的粗 13C 核磁共振谱。 插图显示了在 239 和 117 ppm 处的 Carbene 碳和骨架碳。 其他共振是溶剂混合物中的 THF 和来自 7 抗衡离子的释放的 NMe3。

讨论

为了确认 Carbene 7′ 相比于报道的耐水物质 4′ 和 5′ 具有特殊的水稳定性，我们决定合成这些 Arduengo 型 NHC，并重新研究它们在过量的水中如何表现。 当用一当量的蒸馏 H2O 处理化合物 4′（Arduengo et al. (21) 的所谓耐空气 Carbene）的苯或 THF 溶液时，在将样品加载到核磁共振谱仪中时，它会被完全消耗掉。 这些产物包括未鉴定的物质和暗示开环水解的共振（图 S12 至 S16）。 当 NHC 5′ 的 THF 溶液暴露于 11 当量的 H2O 时，在记录核磁共振谱之前，它会完全发生开环水解（图 S16 和 S17）。 如果使用少于 11 个当量，类似于 Denk et al. (22)，我们在 1H 核磁共振谱中观察到 NHC 5′ 以及水解产物的存在。

为了深入了解 NHC 7′ 为什么在水中稳定，我们决定通过基于密度泛函理论 (DFT) 的量子力学在 B3LYP/6-311G**++ 水平计算几个咪唑鎓盐的 p K a（其中 K a 是酸解离常数）（图 S23 和 S24）。 通过将我们的理论值与两个报告的关于咪唑鎓盐的实验研究 (27–28) 进行比较，验证了这种基于量子力学的方法（exp = 23.8 ± 0.5，Calc = 24.8 和 exp = 23.0 ± 0.5，Calc = 25.6）。 考虑到实验误差，DFT 产生了对咪唑鎓盐的真实 p K a 的可靠估计。 正如图 4所示，非氯化的咪唑鎓盐 3、5 和 6 都具有远高于 20 的 p K a 值。 对于 Arduengo 的所谓耐空气 Carbene 前体 4，计算出的 p K a 为 17.7，这与两个芳基环和两个骨架氯的组合吸电子效应是一致的。 鉴于水的 p K a 为 14.0，预计 Carbene 4′ 到 6′ 在水中不稳定，因为与共轭酸的平衡高度有利于咪唑鎓盐。 相反，过氯化咪唑鎓盐 7 的理论 p K a 为 11.9，使其比水酸性至少高两个数量级，平衡强烈有利于 Carbene 形式。 这些发现与氯化提供的 Carbene 中心的 σ 和 π 平面中的动力学保护相结合，解释了为什么 7′ 在至少 6 个月内稳定且对水不反应。 此外，我们观察到 7′ 在苯偶姻或酰偶姻缩合反应中没有催化活性。 此外，我们尝试了无数次与无数种过渡金属前体、杂环累积烯和元素硒的反应，除了在高温下完全分解外，没有观察到任何反应。 这排除了我们通过实验衡量该分子的 σ 和 π 供体性质的可能性。 这种不反应性是可以预期的，因为孤对电子本质上在空间上无法被超出质子的分子接近，如图 3中空间填充模型所强调的那样。 这些在空间上保护反应性中间体的策略通常会导致它们典型行为的延迟，但尽管如此，允许快照通常在凝聚相中无法通过光谱学观察到的物质。 此外，我们在补充材料中包含了所有这些 Carbene 的完整分子轨道能量分析（图 S25 至 S30），但由于双负电荷，无论是否有溶剂化的 Li+ 抗衡离子，势能的幅度都是不可靠的。

图 4. 相关 NHC 共轭酸的计算 p K a 值。 本文讨论的不同咪唑鎓盐的计算 p K a 值。 未标记的顶点：对于 6 为 B-H，对于 7 为 B。

在 Breslow 的研究导致他提出 Carbene 可以在水中存在足够长的时间以充当 B1 的活性衍生物这一有远见的假设 80 多年后，我们通过核磁共振提供了明确的光谱证据，表明 Breslow 可能是正确的。 此外，我们可以在水的存在下生长适合于单晶 X 射线衍射的晶体，并且实际上在水中产生稳定的 Carbene，这一事实表明，人类的聪明才智可以用来驯服最具反应性的化学实体。 虽然这种 Carbene 并不能完全模拟蛋白质活性位点，但碳硼烷簇提供的空间保护及其在等同性中的作用可以让我们了解这些反应性物质如何在生物系统中普遍存在。

材料和方法

作为一般考虑因素，除非另有说明，所有操作均使用标准 Schlenk 或手套箱技术（O2、H2O < 1 ppm）在二氮或氩气气氛下进行。 溶剂在钠钾合金或钾二苯甲酮酮基中干燥，并在使用前在氩气下蒸馏。 化合物 6 是根据文献方法制备的 (25)。 试剂从商业供应商处购买，无需进一步纯化即可使用。 核磁共振波谱仪是在 Bruker Avance 300 MHz、Bruker Avance Neo 400 MHz、Bruker Avance 600 MHz、Bruker Avance III 700 MHz、Varian Inova 300 MHz 或 Varian Inova 400 MHz 光谱仪上记录的。 核磁共振化学位移以百万分之一为单位报告。 1H 核磁共振和 13C 核磁共振化学位移以残余溶剂为参考。 11B 核磁共振化学位移以外部参考 BF3· OEt2 为参考。 高分辨率质谱是在使用电喷雾电离技术的 Agilent Technologies 6210（飞行时间液相色谱-质谱）上记录的。 所有化合物和计算的完整材料和方法可在补充材料中找到。 化合物 7′ 的完整晶体学数据可从剑桥晶体学数据中心 (CCDC) 免费获得，参考编号分别为 1848698。 这些结构的晶体学数据可以通过 CCDC 网站访问：www.ccdc.cam.ac.uk/Community/Requestastructure/Pages/DataRequest.aspx。

致谢

感谢 H. M. Nelson 的评论。 资助： V.L. 和 W.A.G. 分别感谢美国国家科学基金会 CHE-2003418 和 CBET 2311117。 作者贡献： 方法论：V.L.、S.E.M.、S.G.M.、V.T.R.、A.G. 和 I.B.。 调查：V.L.、S.E.M.、S.G.M.、V.T.R.、A.G.、I.B.、C.B.M. 和 W.A.G.。 可视化：V.L. 资金获取：V.L.。 项目管理：V.L.。 监督：V.L. 和 W.A.G.。 写作 - 原始草稿：V.L.。 写作 - 评论和编辑：V.L.、S.E.M.、S.G.M.、V.T.R.、A.G.、I.B.、C.B.M. 和 W.A.G.。 利益冲突： 作者声明他们没有利益冲突。 数据和材料的可用性： 评估本文结论所需的所有数据均存在于本文和/或补充材料中。

补充材料

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补充文本 图 S1 至 S31 表 S1 至 S3

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Science Advances Volume 11 | Issue 15 April 2025

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收到：2024 年 7 月 23 日 接受：2025 年 3 月 7 日

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