利用 CRISPR-Cas 技术进行蜘蛛眼部发育编辑和丝纤维工程改造

Spider Eye Development Editing and Silk Fiber Engineering Using CRISPR-Cas

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该研究成功开发了针对蜘蛛的 CRISPR-Cas9 基因编辑方案，实现了基因敲除和敲入。通过敲除 _sine oculis_ 基因，证实了其在蜘蛛眼睛发育中的作用。此外，研究人员将红色荧光蛋白敲入蜘蛛丝基因，成功制造出红色荧光丝，证明了 CRISPR 技术在蜘蛛丝纤维工程中的可行性，为发育遗传学和材料科学研究提供了新思路。

[正文内容]

图文摘要

蜘蛛具有独特的特征，对多个领域具有重要意义，而基因编辑为推进这些领域的研究提供了新的机会。在这项研究中，我们开发了一种针对蜘蛛的 CRISPR-Cas9 方案，能够进行基因敲除/敲入，以研究基因功能并引入新的表型特征。

摘要

CRISPR-Cas9 基因编辑是一种有效且精确的技术，可在基因组中诱导突变，已被应用于多种生物体，用于各种目的。然而，迄今为止，尚未见关于在蜘蛛中使用基于 CRISPR 的基因编辑的报道。在这项研究中，我们展示了在亲代蜘蛛中进行 CRISPR 介导的显微注射，从而导致蜘蛛后代中出现敲除 (KO) 和敲入 (KI) 突变。基因 sine oculis 的 KO 导致完全失明，证实了该基因在所有蜘蛛眼睛发育中的作用。在蜘蛛 Parasteatoda tepidariorum 的主要壶状丝基因（编码主要壶状丝的一种成分）中 KI 单体红色荧光蛋白 (mRFP-KI) 会产生红色荧光丝纤维。这一发现证明了使用基于 CRISPR 的基因编辑在蜘蛛中功能化丝蛋白的可行性，而不会影响丝的组装。我们的研究扩展了 CRISPR 在蜘蛛中的应用，并为发育遗传学和材料科学领域提供了见解。

引言

在过去的十年里，基因编辑工具 CRISPR-Cas9（成簇的规律间隔的短回文重复序列和 CRISPR 相关蛋白 9）彻底改变了生物学领域。[1, 2] Cas9 蛋白包含两个核酸内切酶结构域，能够在特定的 DNA 靶区域诱导双链断裂 (DSB)。该蛋白与单链 RNA (ssRNA) 结合，该 RNA 称为引导 RNA (gRNA)，其序列被设计为与前间隔序列相邻基序 (PAM) 旁边的靶区域互补，从而诱导 DSB。[3] 发生 DSB 后，细胞有两种主要的替代途径来修复 DNA。第一个也是最不精确的途径是非同源末端连接 (NHEJ)，当两个裂解的 DNA 链结合在一起时发生，通常会发生突变，从而损害蛋白质的正常功能。第二种也是更精确的修复机制称为同源定向修复 (HDR)，其中同源染色体用作模板来恢复裂解区域。NHEJ 通常用于诱导基因敲除 (KO)，因为它允许引入错误，这些错误会影响感兴趣的基因，例如，导致提前终止密码子或翻译中的错误，从而导致未完成或截短的蛋白质，其功能降低或完全丧失，这有助于描述蛋白质的作用（图 [1a](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0001>））。另一方面，HDR 用于通过使用同源染色体或通过添加供体模板来敲入 (KI) 特定序列。对于供体模板，KI 序列两侧是与靶区域互补的序列，从而误导修复机制认为它是同源染色体，并驱动将所需序列从供体复制到预期的基因组 DNA 序列中[4]（图 [1a](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0001>））。由于其有效性，CRISPR 已被应用于发育和进化生物学中的广泛研究[5-7]以及各种应用，例如材料科学[8, 9]、害虫防治[10, 11]和农业[12, 13]。考虑到其在不同科学学科中的广泛应用，然而，令人惊讶的是，没有关于蜘蛛相关 CRISPR 应用的报告。

Figure 1 Open in figure viewer PowerPoint CRISPR-Cas9 诱导的蜘蛛基因修饰。a) Cas9 蛋白与设计的引导 RNA (gRNA) 结合，该 RNA 与蜘蛛基因组的目标区域互补。[1, 2] 由此产生的核糖核蛋白 (RNP) 复合物随后与基因组中的互补 DNA 链结合，在前间隔序列相邻基序 (PAM) 区域附近诱导双链断裂 (DSB)。[3] 原则上，这种裂解可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 来修复。b) 蜘蛛用 CO2 麻醉，以防止注射过程中的移动。在立体显微镜下用手握住它们，同时将装载的毛细管针插入后体侧面，以输送 RNP 溶液，避免重要器官。之后，引入雄性进行受精。最后，收集并饲养卵。c) gRNA 被设计为敲除 (KO) 眼睛发育基因 sine oculis (C1) 或靶向蜘蛛丝基因 major ampullate spidroin 2 以诱导单体红色荧光蛋白 (mRFP) 基因的敲入 (KI) (C2)。

值得注意的是，蜘蛛的进化成功取决于它们所拥有的特殊特征，这些特征不仅为广泛的科学问题提供了有价值的见解，而且突显了它们作为研究对象的重要性。[14-16] 有几个因素导致蜘蛛在研究中的代表性不足：首先，它们是一个多样化的群体，很难说明每一个物种[17]；其次，由于它们的基因组结构，包括基因组复制[18]；第三，由于它们的同类相食性，必须单独饲养它们，这与其他挑战相结合，使它们的研究复杂化。[16] 与蚊子[11]和蟑螂[19]等其他节肢动物相比，所有这些因素导致蜘蛛在实验室研究中的代表性不足。

然而，蜘蛛发育和遗传研究的最新进展使得普通家蜘蛛 Parasteatoda tepidariorum 和虎纹游猎蛛 Cupiennius salei 能够在受控的实验室条件下作为研究蜘蛛生物学的研究模型而建立起来。[16, 20] 这项研究非常重要，因为蜘蛛是节肢动物中与六足亚门最遥远的群体之一[21]，因此提供了有趣的进化和发育比较。例如，蜘蛛具有独特的个体发育，具有不同的细胞迁移和其他特征，包括早期细胞化和短暂的合胞期，[16, 22] 使它们成为研究早期个体发育期间细胞间通讯和相互作用的卓越模型。因此，我们强调在蛛形纲中开发基因编辑工具对于阐明基因与发育过程中表型特征的特定功能非常重要，更重要的是，阐明那些在中后期若虫阶段形成的基因，否则无法对其进行研究。此外，蛛形纲最著名的是它们的丝，这是材料科学领域的一个标志性纤维。[23, 24] 因此，成功的体内蜘蛛丝工程将有助于开发和应用新的纤维功能，以用于广泛的应用。到目前为止，对蜘蛛进行的基因修饰仅以进化和发育研究为目的。这些研究仅限于 RNA 干扰 (RNAi) 实验，这些实验受到基因表达的时空限制的约束。由于蜘蛛 P. tepidariorum 最近被确立为研究蜘蛛生物学的研究原型，[25-28] 因此它是开发 CRISPR 基因编辑的绝佳模型。

结果与讨论

想知道为什么 CRISPR-Cas9 基因编辑显然迄今为止尚未在蜘蛛中使用，我们想找出这项工作背后的挑战。在多次失败的设置后，我们研究了将 CRISPR 溶液显微注射到 P. tepidariorum 成年雌性蜘蛛的血淋巴中，使其到达卵巢并使其后代发生突变后的 CRISPR-Cas9 编辑。在进行该过程时，蜘蛛用 CO2 麻醉以防止它们移动。然后在立体显微镜下用手握住蜘蛛，同时将装载的毛细管针注射到腹部侧面，以输送约 2 µL 显微注射溶液，该溶液包含 Cas9:gRNA（1 µg µL−1:800 ng～1 µg µL−1）（图 [1b](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0001>））。显微注射溶液在与雄性对应物交配之前处理蜘蛛的卵母细胞。此过程使我们能够建立一种在蜘蛛中实施基于 CRISPR 的 KO 和 KI 基因编辑的方案。主要目标是修改蜘蛛丝（图 [1c](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0001>）），即主要壶状丝基因 major ampullate spidroin-2 (masp2)。但由于在蜘蛛中建立 CRISPR-Cas9 技术的困难，我们首先选择了一种易于追踪的 KO 基因，即 sine oculis (so)，也称为 Sox1 和 soA（图 [1c](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0001>））。基因 so 调节蜘蛛的眼睛发育，但对于生存不是必需的，因此 so 的 KO 应该导致易于检测到的表型。

CRISPR 诱导的基因敲除 (KO)

基因 so 先前已通过蛛形纲动物的比较进化发育研究确定，负责所有眼睛的发育（图 [2a](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0002>））。[25, 26, 29, 30] 相应地，选择它用于 CRISPR-KO 实验，因为该基因的突变会导致强烈的表型，有助于筛选后代中的任何突变。[25] 使用光学筛选分析后代，以确定眼睛结构是否缺失或改变。我们还使用 P. tepidariorum 的自发荧光来探索突变体表型，并描述 CRISPR-KO 后受影响的蜘蛛眼睛的不同部分。[31, 32]

Figure 2 Open in figure viewer PowerPoint 眼睛发育基因 sine oculis (so) 的 CRISPR 敲除。a) 蜘蛛眼睛反映了进化适应。球腹蛛科和园蛛科等蜘蛛依靠丝网捕食食物，而跳蛛科则具有较大的前眼用于视觉狩猎。与完全减少眼睛的穴居动物群（例如 C. isrealensis ）的比较，确定 so 是眼睛发育的关键基因。[25, 26, 29, 30] 根据发育起源，蜘蛛眼睛分为侧眼（灰色）和前眼（红色）。b) P. tepidariorum 中 so 的 CRISPR 敲除产生了突变，范围从主要的眼睛缺失 (mt -1、mt -4) 到部分缺失 (mt -2、mt -3)。在 mt -1 中，除了晶状体外，大多数眼睛结构都缺失，而 mt -4 显示眼睛结构完全缺失。在 mt- 2 中，脉络膜和侧眼结构缺失，尽管一些视蛋白仍然存在于前内侧眼中。荧光显微镜 (*) 显示角质层保持完整。值得注意的是，在所有突变体中，覆盖晶状体的角质层都正常发育，这表明其形成是 so 独立的。mt -3 显示出不对称，一只前眼缺失，而另一只前眼发育正常（比例尺：2 毫米）。右下角的模型结合了侧眼和前眼结构，以帮助理解受影响的部分。

可以证实，CRISPR-KO 影响了相应蜘蛛的所有眼睛的发育，支持了先前描述的 so 的作用（图 [S1A](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#support-information-section>））。[25] 虽然大多数胚胎缺乏任何视觉表型，但一些胚胎确实表现出在野生型对应物中未观察到的不规则眼睛发育。最引人注目的表型是所有眼睛或前内侧眼睛的缺失，这两种情况都可以使用立体显微镜清楚地看到（图 [2b](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0002>））。引人注目的是，侧眼的突变也完全缺乏脉络膜和其他结构。唯一从未受到影响的眼睛结构是晶状体，这表明它具有不同的发育起源。为了进一步探索表型效应，我们使用了 P. tepidariorum 在暴露于蓝光下的绿色自发荧光，以更好地可视化基因编辑效应（图 [2b](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0002>））。在某些情况下，人们注意到，在眼睛形成之前的红棕色环要么没有形成，要么在其应该发育的地方失去了形状。这一发现支持了基因 so 的功能是开启或关闭与所有蜘蛛眼睛（包括眼睛图案基因）的眼睛发育中涉及的基因表达相关的发育途径。值得注意的是，这证实了 so 是眼睛发育的重要基因，影响其表达会导致蜘蛛所有眼睛的部分到完全变形（图 [S1B](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#support-information-section>））。[25, 29]

CRISPR-KO 基因分型

电泳（图 [S2](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#support-information-section>））和 Sanger 测序（图 [S3](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#support-information-section>））用于评估我们方法的基因修饰效率。前者用于显示条带的大小和数量，这表明扩增的质量。使用 Synthego-Inference of CRISPR Edits (ICE) 分析工具[33]分析序列，这是一种专门设计用于识别和描述 DNA Indel（CRISPR 裂解后引起的 DNA 序列变异）的生物信息学软件。结果表明，CRISPR 在目标 gRNA 位点附近切割，但产生了不同的 Indel。由于蜘蛛在显微注射时是处女，并且仅在显微注射后才受精，因此我们的结果表明 CRISPR 诱导的切割发生在受精和早期细胞切割时。如果只有一个细胞或延长的合胞期，我们预计突变率会达到 50% 或更高。相反，我们观察到的突变率低于 50%，因为可能发生了早期细胞化，并且 CRISPR-Cas9 核糖核酸复合物必须穿过细胞膜。突变体样本在其 DNA 序列中显示出各种类型的突变，范围从部分到完全切割（图 S4–[S7](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#support-information-section>））。然而，大多数样本显示出嵌合突变，这是 CRISPR 介导的编辑的典型特征。关于显微注射效率，从 59 个卵囊中采样了 90 到 100 个若虫，其中四个卵囊携带突变体后代。在采样的后代中，有 12 个表现出表型变异，其中 5 个通过测序证实携带 CRISPR 在目标位点诱导的突变（表 [S1](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#support-information-section>））。在高后代数量的物种中，通常会观察到每个个体的低突变频率，尤其是在直接向亲本进行显微注射时。[10, 34-36] 我们还观察到，只有显微注射蜘蛛产下的第一个卵囊包含突变体后代。未来的方法应考虑排卵时间，以优化卵对核糖核蛋白的吸收，因为它们更有可能在此阶段吸收蛋白质。[19]

CRISPR 诱导的敲入 (KI)

在成功建立基于 CRISPR-Cas9 的蜘蛛基因工程后，我们接下来旨在功能化其蜘蛛丝，并选择了几个主要的壶状丝蛋白 (MaSp) 之一，即 MaSp2。织网蜘蛛产生多达七种不同类型的丝，这些丝的组成和机械性能各不相同。研究最多的蜘蛛丝类型是主要壶状丝，MaSp 代表主要壶状丝纤维的主要部分，用作生命线和网的框架形成纤维。[37-39] 主要壶状丝的蛋白质组成已被充分描述，两种主要的蛋白质成分是 MaSp1（脯氨酸残基含量低的蛋白质）和 MaSp2（脯氨酸残基含量高的蛋白质），[40, 41] 它们共同负责主要壶状丝的大部分机械特性。主要壶状丝纤维的最大强度高达 1.7 GPa，与合成高科技材料的范围相当。然而，这种蜘蛛丝纤维比例如 Kevlar 和碳纤维具有更高的韧性和延伸性，这基于高抗拉强度和弹性的结合。[42] 所有 MaSp 都包含一个大的中央重复序列基序结构域，两侧是非重复 (NR) 结构域，由 100-140 个氨基酸组成，在不同的蜘蛛物种和丝类型之间高度保守。侧翼 NR 氨基末端 (NTD) 和羧基末端结构域 (CTD) 调节 MaSp 在储存期间和沿着纤维纺丝的组装，而中央重复序列负责纤维的机械性能。[37, 43-46]

我们以 P. tepidariorum 的 MaSp2 核心结构域的最后一个重复基序和 CTD 连接的连接子区域为目标，敲入单体红色荧光蛋白 (mRFP)，因为该连接子序列在蜘蛛之间是保守的，但预计不会参与蛋白质的组装。在 pEX-A258 载体中的显微注射 mRFP 序列被设计为两侧是 MaSp2 目标区域上游和下游的连接子-CTD 序列。此外，它包含 gRNA 靶区域，以便在与 CRISPR:gRNA 溶液（mRFP 质粒 100 ng µL−1、Cas9: 1 µg µL−1、gRNA: 1 µg µL−1）一起显微注射时进行切割和线性化。因此，如果在 CTD 之前的连接子区域成功插入，则认为会导致主要壶状丝纤维发出红色荧光。事实上，产生的突变丝显示出红色荧光（图 [3a](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0003>））。

Figure 3 Open in figure viewer PowerPoint 使用 CRISPR-Cas9 将 mRFP 序列 KI 到蜘蛛主要壶状丝中。a) 在毛细管玻璃上滚动的 wt 和 mRFP 修饰的主要壶状丝纤维的比较（比例尺：550 µm）。b) 在主要壶状腺中也可以看到强烈的红色荧光（比例尺：277 µm）。c i) 通过扩增从蜘蛛腿提取的 mRFP DNA 序列，证实了 mRFP 在主要壶状丝中的基因组实现。只有那些具有红色荧光丝的蜘蛛（比例尺：138 µm）在琼脂糖凝胶中显示出 mRFP 序列衍生的信号。C ii) 从腺体中提取 Total-RNA，进行逆转录，并进行 R-TqPCR 和熔解曲线分析，显示基于小和大扩增片段的峰值分别为 83°C 和 87°C。

然后用 CO2 麻醉显示红色荧光丝的相应个体，以取下一条腿进行 DNA 基因分型。扩增 mRFP-DNA，并使用电泳观察扩增子的存在。然后解剖那些具有扩增 mRFP-DNA 的蜘蛛的主要壶状丝腺，并扩增其 RNA（图 [3b,c, i](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#anie202502068-fig-0003>））。然后繁殖携带突变的蜘蛛，并进一步描述其后代。由于外骨骼没有色素且半透明，因此在早期阶段进行后代筛选。一些后代表现出后体内的红色荧光，类似于丝腺的形状（图 [S8](https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/<#support-information-section>））。在此基础上，我们已经能够建立一条稳定的蜘蛛品系。

不幸的是，仅通过显微镜而不进行解剖